Nowe możliwości w terapii COVID-19 – repurposing leków daje nadzieję

Jakie wyzwania niesie pandemia COVID-19 dla terapii?

Pandemia COVID-19 spowodowana przez wirusa SARS-CoV-2 stanowi znaczące zagrożenie dla zdrowia publicznego, infekując ponad 600 milionów ludzi i powodując ponad 6 milionów zgonów. Pomimo szeroko zakrojonych kampanii szczepień, nowe warianty wirusa nadal się pojawiają, budząc obawy co do skuteczności szczepionek przeciwko tym wariantom. Wielu pacjentów nadal doświadcza ciężkich objawów i powikłań wymagających hospitalizacji, szczególnie osoby z chorobami współistniejącymi takimi jak nadciśnienie, cukrzyca, niewydolność serca i nowotwory. Podkreśla to potrzebę opracowania nowych metod leczenia COVID-19. W związku z tym, repurposing istniejących leków zatwierdzonych przez FDA może być najszybszym i najbardziej efektywnym kosztowo podejściem do walki z COVID-19.

Według CDC i NIH, zatwierdzone leki do leczenia COVID-19 dzielą się na dwie kategorie: te ukierunkowane na białka wirusowe i te modulujące odpowiedź immunologiczną gospodarza. Leki ukierunkowane na białka wirusowe obejmują ritonavir-boosted nirmatrelvir, remdesivir i molnupiravir. Leki modulujące odpowiedź immunologiczną gospodarza obejmują deksametazon, baricitinib i tocilizumab, które pomagają zarządzać burzą cytokinową podczas infekcji SARS-CoV-2. Ogólnym problemem związanym z lekami ukierunkowanymi na białka wirusowe jest rozwój szczepów opornych. W rzeczywistości wszystkie wcześniej zatwierdzone terapie przeciwciałami neutralizującymi anty-spike, takie jak etesevimab, bebtelovimab, casirivimab, imdevimab i sotrovimab, wykazały zmniejszoną skuteczność przeciwko subliniom Omicron BQ.1, BQ.1.1 i XBB. Zgłoszono również mutacje w wirusowej polimerazie RNA zależnej od RNA, na którą działają remdesivir i molnupiravir, a także w głównej proteazie wirusowej (M-proteaza lub M^pro), na którą działają ritonavir i nirmatrelvir. Dlatego poszukiwanie alternatywnych terapii pozostaje pilne, ze szczególnym uwzględnieniem ukierunkowania na czynniki gospodarza, które są niezbędne dla cyklu życiowego SARS-CoV-2.

SARS-CoV-2 jest otoczkowym, jednoniciowym wirusem RNA o dodatniej polarności z rodziny Coronaviridae. Jego genom koduje białka strukturalne, a mianowicie białka kolca (S), otoczki (E), nukleokapsydu (N) i błony (M), wraz z białkami niestrukturalnymi i pomocniczymi. Białko S odgrywa kluczową rolę w przyłączaniu się wirusa, fuzji i wnikaniu do komórek gospodarza. Składa się z dwóch podjednostek, S1 i S2. Podjednostka S1 zawiera domenę wiążącą receptor (RBD), która wiąże się z receptorem enzymu konwertującego angiotensynę 2 (ACE2) na powierzchni komórki gospodarza. Za ich wiązaniem następuje rozszczepienie białka S wirusa, ułatwiając fuzję i wejście wirusa. Wykorzystanie ACE2 przez SARS-CoV-2 do wnikania do komórek gospodarza czyni go atrakcyjnym celem terapeutycznym. W rzeczywistości, niedawne badanie wykazało, że ACE2 może być blokowany przez rekombinowany fragment RBD, hamując w ten sposób wnikanie SARS-CoV-2 do komórek ekspresjonujących ACE2.

Naszym głównym celem było zidentyfikowanie leków, które potencjalnie mogłyby być wykorzystane do zahamowania punktu wejścia SARS-CoV-2, receptora ACE2. Nasze podejście obejmowało początkową fazę przesiewu obliczeniowego leków zatwierdzonych przez FDA, a następnie walidację eksperymentalną w celu oceny ich zdolności do zakłócania wiązania między wirusowym białkiem S a receptorem ACE2 gospodarza. W przypadku obiecujących kandydatów przeprowadziliśmy oceny funkcjonalne, aby zrozumieć ich mechanizmy anty-SARS-CoV-2.

Jak opracowano metodologię badań leków?

W naszym badaniu przeprowadziliśmy in-silico screening biblioteki leków zatwierdzonych przez FDA (Drug Bank, Kanada), zawierającej około 2500 leków, przy użyciu symulacji dokowania molekularnego za pomocą oprogramowania Molecular Operating Environment (MOE) wobec rozwiązanej struktury krystalicznej domeny wiążącej receptor białka kolca SARS-CoV-2 związanej z ACE2 (PDB ID: 6M0J). Leki zostały przygotowane przez dodanie wodoru/ładunków częściowych i zminimalizowane energetycznie przy użyciu pola siłowego MMFF94 z gradientem średniej kwadratowej (RMSD) 0,01 kcal/mol i odległością RMS 0,1 Å. Struktury białek przygotowano przez usunięcie cząsteczek wody i powtarzających się łańcuchów. Wykonano protokół MOE QuickPrep, protonowanie 3D i obliczenie ładunków częściowych w celu optymalizacji kwestii strukturalnych. Zastosowano domyślne procedury z parametrami protokołu dokowania MOE, aby wybrać najlepsze pozy wiązania dla zadokowanych związków. Aby oszacować profil energetyczny oparty na powinowactwie wiązania w odniesieniu do interakcji hydrofobowo-hydrofobowych, uzyskane pozy dokowania zostały oszacowane, a interakcje z miejscem aktywnym zostały uwzględnione na podstawie metody punktacji London dG. Ostatecznie, aby wybrać najlepiej pasujące pozy do miejsca aktywnego wyrażające najlepszy wynik S skorelowany z najlepszymi interakcjami z białkiem, przeprowadzono inspekcję wizualną. Wybrano leki z wynikami S <10 kcal/mol do walidacji eksperymentalnej. Wykluczono leki o niskim profilu bezpieczeństwa, takie jak leki znane z szerokiego zakresu działań niepożądanych lub wąskich wskaźników terapeutycznych.

Zakupiono następujące leki: tirofiban chlorowodorek jednowodny, atowakwon, acenokumarol, resweratrol, argatroban jednowodny, glimepiryd, zanamiwir, tamsulosyna chlorowodorek, gefitynib, ranolazyna dichlorowodorek, topiramat, terbutalina półsiarczan, leukoworyna kwas folinowy wapniowy sól uwodniona, leukoworyna wapniowa sól, tiagabina chlorowodorek, kwas kromoglicic (wszystkie zakupione od Sigma-Aldrich), arbutamina, oksytryptan (oba zakupione od Santa Cruz), glutation (TOCRIS) i ibandronian sodu (USP). Leki były rekonstytuowane w zalecanej ilości rozpuszczalnika (woda lub DMSO) zgodnie z instrukcjami producenta.

Potencjał wyselekcjonowanych leków do hamowania wiązania między białkiem S SARS-CoV-2 a receptorem ACE2 oceniano przy użyciu zestawu do badania wiązania COVID-19 Spike-ACE2 (RayBiotech) zgodnie z instrukcjami producenta. Wykorzystano dwie wersje zestawu: płytkę 96-dołkową pokrytą rekombinowaną domeną wiążącą receptor białka kolca (S-RBD) oraz płytkę 96-dołkową pokrytą ACE2. Obie wersje zestawu działają na tej samej zasadzie i zostały użyte do potwierdzenia wyników. Krótko mówiąc, domena wiążąca receptor białka S (RBD) lub białko ACE2 zostały rozcieńczone i połączone z każdym lekiem, aby uzyskać końcowe stężenie 2 mM. Te mieszaniny dodano do odpowiednich płytek 96-dołkowych i inkubowano przez noc w 4°C. Po przemyciu dodano przeciwciało wykrywające, a następnie przeciwciało sprzężone z HRP na 1 godzinę, a następnie inkubowano z odczynnikiem substratu TMB przez 30 minut. Absorbancję odczytano przy 450 nm za pomocą czytnika płytek wielomodalnych Hidex Sense. Wszystkie eksperymenty zawierały pozytywną kontrolę wiązania (odczynnik testowy ACE2 lub RBD bez leku) i negatywną kontrolę nośnika. Kontrola pozytywna oznacza 100% wiązanie między receptorem ACE2 a białkiem S, dlatego może zweryfikować, czy odczynnik testowy hamuje wiązanie. Puste miejsce nośnika to roztwór, w którym rozpuszczony jest odczynnik testowy i służy jako kontrola negatywna, która wykrywa wszelkie niezamierzone efekty nośnika. Przeprowadzono cztery powtórzenia testu.

Do badań przeciwwirusowych wybrano komórki Vero E6 (małpa zielona afrykańska, nerka; CRL-1586, ATCC) ze względu na ich wysokie wsparcie dla replikacji SARS-CoV-2. Komórki hodowano w medium Eagle’a modyfikowanym przez Dulbecco (DMEM) uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% roztworem antybiotyku i inkubowano w 37°C w nawilżonym inkubatorze z 5% CO₂.

Aktywność cytotoksyczną leków testowano przy użyciu testu fioletu krystalicznego. 3 × 10⁴ komórek wysiewano na płytki 96-dołkowe. Po 24 godzinach komórki traktowano różnymi stężeniami każdego związku w trzech powtórzeniach (1 nM–10 mM). Po 72 godzinach monowarstwy komórek utrwalono 10% formaldehydem i zabarwiono 0,1% fioletem krystalicznym. Komórki przemyto i suszono przez noc, a następnie dodano metanol. Absorbancję mierzono przy λmax 570 nm za pomocą czytnika płytek Anthos Zenyth 200rt (Anthos Labtec Instruments, Heerhugowaard, Holandia). Wartość CC₅₀ obliczono przy użyciu analizy regresji nieliniowej przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism, wykreślając logarytmiczne stężenia związku w stosunku do znormalizowanej odpowiedzi (zmienna nachylenie). Stężenie, które wykazało 50% cytotoksyczność (CC₅₀), obliczono przy użyciu wykresu procentowej cytotoksyczności w stosunku do stężenia próbki. Przeprowadzono trzy powtórzenia testu.

Wartości IC₅₀ określano podobnie. Krótko mówiąc, 2,4 × 10⁴ komórek Vero E6 hodowano przez noc na płytkach 96-dołkowych. Alikwot zawierający 100 TCID₅₀ wirusa SARS-CoV-2 “NRC-03-nhCoV”, szczepu wyizolowanego w Egipcie w marcu 2020 r., wykazującego 99,9% identyczności z izolatem z Wuhan (2019-nCoV WHU01), inkubowano z seryjnie rozcieńczonymi stężeniami (1 nm–10 mM) leków w 37°C przez 1 godzinę. Komórki inkubowano z mieszaniną wirusa/związku przez 72 godziny, utrwalono 10% paraformaldehydem i zabarwiono 0,5% fioletem krystalicznym w temperaturze pokojowej. Barwnik fioletem krystalicznym rozpuszczono przy użyciu absolutnego metanolu, a absorbancję mierzono przy λmax 570 nm. Nieleczone komórki zakażone wirusem reprezentują kontrolę wirusa. Niezakażone komórki traktowane tylko nośnikiem rozpuszczania leku (DMSO/woda) były używane jako kontrola negatywna. IC₅₀ związku to dawka wymagana do zmniejszenia efektu cytopatycznego (CPE) wywołanego przez wirusa o 50%, w stosunku do kontroli wirusa. Wartość IC₅₀ obliczono przy użyciu analizy regresji nieliniowej, wykreślając logarytmiczne stężenia związków w stosunku do znormalizowanej odpowiedzi (zmienna nachylenie). Przeprowadzono trzy powtórzenia testu.

Aby określić, na który etap (y) replikacji wirusowej wpływa leczenie argatrobanem, ranolazyną i glimepiridem, trzy leki przetestowano pod kątem ich wpływu na replikację wirusową, adsorpcję i efekt wirusobójczy bezkomórkowy. We wszystkich opisanych poniżej testach przeprowadzono trzy powtórzenia i zastosowano następujące kontrole: kontrola komórkowa (niezakażone i nieleczone komórki używane do zapewnienia ważności testu) oraz kontrola wirusa (zakażone komórki, które nie były leczone lekami, używane do obliczenia procentowego hamowania wirusa po leczeniu lekiem).

Aby ocenić hamowanie replikacji wirusowej, komórki Vero E6 hodowano w gęstości 1,2 × 10⁶ komórek/dołek na płytce 6-dołkowej przez noc. Komórki traktowano inokulum SARS-CoV-2 przez 1 godzinę. Monowarstwy komórek przemyto 1X PBS, a następnie traktowano wcześniej określonymi niecytotoksycznymi stężeniami każdego związku, a następnie inkubowano w 37°C przez 1 godzinę. Komórki przemyto, a następnie dodano nakładki 2% agarozy. Płytki pozostawiono do zestalenia w 37°C w 5% CO₂ przez 72 godziny. Monowarstwy komórek utrwalono i zabarwiono przy użyciu 0,1% roztworu fioletu krystalicznego. Plakietki wirusowe liczono, a procentową redukcję w tworzeniu plakietek w porównaniu do dołków kontrolnych obliczano.

Aby ocenić hamowanie adsorpcji wirusowej, komórki Vero E6 hodowano na płytkach 6-dołkowych (1,2 × 10⁶ komórek/dołek) i inkubowano z lekami w 4°C przez 1 godzinę, aby umożliwić adsorpcję chemiczną na receptorach komórkowych bez aktywnej penetracji. Płytki przemyto 1X PBS, aby usunąć pozostałe związki. Następnie zastosowano rozcieńczenie wirusa SARS-CoV-2, aby umożliwić adsorpcję/infekcję wirusową, i rozpoczęto kolejny okres inkubacji w 37°C w 5% CO₂ przez 1 godzinę. Aby usunąć pozostały wirus, monowarstwy komórek przemyto 1X PBS, a następnie pokryto 2% agarozą/DMEM i inkubowano w 37°C w nawilżonym 5% CO₂ przez 72 godziny. Monowarstwy komórek ostatecznie utrwalono i zabarwiono, a redukcję plakietek oceniono jak opisano powyżej.

Aby ocenić efekt wirusobójczy, przeprowadzono prosty test redukcji plakietek, w którym skuteczne stężenia związków mieszano ze skoncentrowanym wirusem SARS-CoV-2 (3–4 razy wyższe niż policzalne rozcieńczenie wirusa). Następnie inkubowano mieszaninę wirusa/związku w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Następnie wykonano dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia mieszaniny wirusa/związku (3 lub 4 razy), aby osiągnąć policzalny miano wirusa. Rozcieńczenie mieszaniny z policzalnym mianem wirusa zastosowano do monowarstw Vero E6 (1,2 × 10⁶ komórek/dołek), w tym dołków kontrolnych komórek i wirusa. Płytki inkubowano w 37°C w nawilżonym inkubatorze z 5% CO₂ przez 1 godzinę. Komórki przemyto 1X PBS, a następnie pokryto 2% agarozą/DMEM i inkubowano w 37°C w inkubatorze z 5% CO₂ przez 72 godziny. Monowarstwy komórek utrwalono i zabarwiono, a redukcję plakietek oceniono jak opisano powyżej.

Testy statystyczne przeprowadzono przy użyciu GraphPad Prism 10. Wyniki przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe. Ponieważ analiza danych obejmowała porównanie dwóch grup nieparzystych danych wynikowych, zastosowano nieparzysty test t-studenta. Wartość p <0,05 uznano za statystycznie istotną, gdzie ∗ = p < 0,05, ∗∗p < 0,01 i ∗∗∗p < 0,001. Dla każdego eksperymentu wykonano co najmniej trzy powtórzenia.

Czy wyniki badań wskazują na nowe możliwości terapeutyczne?

Spośród 19 testowanych leków, pięć wykazało statystycznie istotne i spójne hamowanie w co najmniej jednym z dwóch formatów testu wiązania. Tymi pięcioma lekami są argatroban, glimepiride, ranolazine, kwas kromoglicic i resveratrol, ze średnim hamowaniem wiązania odpowiednio 6,3% (p = 0,0094), 4% (p = 0,0017), 7% (p = 0,0072), 7,1% (p = 0,0003) i 37% (p = 0,0456), w porównaniu z pozytywną kontrolą wiązania.

Początkowo oceniliśmy wpływ pięciu leków (argatroban, glimepiride, ranolazine, kwas kromoglicic i resveratrol) na żywotność komórek Vero E6. Obliczono procent żywotności komórek i wykreślono go w stosunku do logarytmicznego stężenia leku, aby określić stężenie cytotoksyczne (CC₅₀) każdego leku. Następnie komórki Vero E6 zakażono wirusem SARS-CoV-2 “NRC-03-nhCoV” i inkubowano z seryjnymi rozcieńczeniami leków, aby ocenić ich aktywność przeciwwirusową. Obliczono procent hamowania wirusa i wykreślono go w stosunku do logarytmicznego stężenia leku, aby określić stężenie hamujące wirusa (IC₅₀) każdego związku.

W przypadku resveratrolu i kwasu kromoglicic, obliczone wartości IC₅₀ przekraczały ich wartości CC₅₀, co skutkowało indeksem selektywności mniejszym niż 1, wskazującym, że nie są one zalecane do stosowania jako leki przeciwwirusowe przeciwko SARS-CoV-2. Jednakże argatroban, ranolazine i glimepiride wykazały indeks selektywności większy niż 1 (odpowiednio 95, 10 i 61), co czyni je obiecującymi kandydatami do potencjalnego zastosowania przeciwko SARS-CoV-2.

Argatroban wywołał głównie bezpośredni efekt wirusobójczy, wykazując do 90% hamowania wirusowego, podczas gdy wykazał tylko średnie hamowanie 32% i 27% odpowiednio przez etapy adsorpcji i replikacji wirusowej. Glimepiride hamował głównie replikację wirusową, osiągając średnie hamowanie wirusowe wynoszące 91%, podczas gdy średnie hamowanie wirusowe wynoszące 33% i 20% osiągnięto odpowiednio poprzez bezpośredni wpływ wirusobójczy i hamowanie adsorpcji wirusowej. Ranolazine wywierała swój wpływ przeciwwirusowy głównie poprzez hamowanie adsorpcji wirusowej, wykazując średnie hamowanie wirusowe wynoszące 61%, a następnie 47% hamowania poprzez bezpośredni mechanizm wirusobójczy i 35% hamowania na etapie adsorpcji wirusowej.

W ciągu ostatnich lat pandemia COVID-19 dotknęła setki milionów ludzi, nakładając wielkie obciążenie na system opieki zdrowotnej i gospodarki wielu krajów na całym świecie. Pomimo ogromnych wysiłków i szeroko zakrojonych kampanii szczepień, które zostały przeprowadzone, nadal istnieje wiele przypadków obejmujących ciężkie objawy choroby i wiele powikłań wymagających hospitalizacji. Podkreśla to konieczność opracowania środków terapeutycznych do leczenia pacjentów z ciężkim COVID-19 i związanymi z nim powikłaniami, zamiast polegania wyłącznie na zapobieganiu poprzez szczepienia.

Obecnie zatwierdzone leki przeciwwirusowe zalecane do leczenia COVID-19 to ritonavir-boosted nirmatrelvir, remdesivir i molnupiravir, które są stosowane u pacjentów z łagodnymi do umiarkowanych objawami zagrożonych progresją do ciężkiej choroby. Leki te ukierunkowane są na określone białka wirusowe, ale wraz z ciągłym pojawianiem się nowych wariantów wirusa, wirus prawdopodobnie rozwinie oporność przeciwko nim. W rzeczywistości, mutacje w wirusowej polimerazie RNA zależnej od RNA, na którą działają remdesivir i molnupiravir, a także w wirusowej M^pro, na którą działają ritonavir i nirmatrelvir, zostały już zgłoszone. Dlatego potencjalnie bardziej niezawodnym podejściem do obejścia oporności byłoby ukierunkowanie na czynniki gospodarza niezbędne dla cyklu życiowego SARS-CoV-2, takie jak jego droga wejścia przez receptor ACE2. Niedawne badanie wykazało, że dostępny w handlu związek, VE607, wiąże się z interfejsem receptora Spike-ACE2, prowadząc do zmniejszenia replikacji wirusowej SARS-CoV-2 w płucach myszy. Wyniki te dostarczają dowodu koncepcji, że hamowanie wiązania między SARS-CoV-2 a receptorem ACE2 stanowi obiecujące podejście do leczenia COVID-19.

Ponieważ proces odkrywania leków może trwać dziesięciolecia, repurposing obecnie dostępnych leków zatwierdzonych przez FDA jest uważany za jedno z najbardziej efektywnych podejść do znalezienia potencjalnych inhibitorów receptora ACE2. Pozwoliłoby to na szybką identyfikację leków, które mogą zatrzymać rozprzestrzenianie się SARS-CoV-2, i ich szybkie zastosowanie w leczeniu pacjentów z COVID-19, znacznie skracając czas i zmniejszając koszty w porównaniu do odkrywania leków de novo. W tym badaniu biblioteka leków zatwierdzonych przez FDA została wpisana do symulacji dokowania, aby wykryć leki, które potencjalnie wiążą się z receptorem ACE2 lub białkiem S SARS-CoV-2, lub ukierunkowane na interakcje ACE2-Spike. Wygenerowana lista została zawężona do 19 leków na podstawie wyników dokowania i profili bezpieczeństwa.

Aby zweryfikować wyniki obliczeniowe danymi empirycznymi, 19 wyselekcjonowanych leków zostało przebadanych pod kątem ich zdolności do zapobiegania wiązaniu między receptorem ACE2 gospodarza a białkiem S SARS-CoV-2 przy użyciu bezkomórkowego zestawu do badania wiązania COVID-19 Spike-ACE2 opartego na ELISA. Pięć leków wykazało statystycznie istotne hamowanie między wiązaniem receptora ACE2 a białkiem S, w zakresie od 4% do 37%: resveratrol, argatroban, ranolazine, kwas kromoglicic i glimepiride. Z tych tylko trzy leki wykazały obiecujące wyniki w aktywności przeciwwirusowej przeciwko SARS-CoV-2 z indeksem selektywności (SI) większym niż 10: glimepiride, argatroban i ranolazine.

Glimepiride, lek przeciwcukrzycowy, został zgłoszony w poprzednim badaniu przy użyciu podejść do przesiewu obliczeniowego jako potencjalnie ukierunkowany na SARS-CoV-2 M^pro, proteazę wirusową kluczową dla przetwarzania poliproteiny. Podobnie, badanie in silico sugerowało, że glimepiride ma bardzo obiecujące wyniki dokowania molekularnego przeciwko wielu krytycznym białkom SARS-CoV-2, w tym M^pro, proteazie podobnej do papainy i polimerazie RNA zależnej od RNA. Jednak wpływ glimepiridu przeciwko SARS-CoV-2 nigdy nie został eksperymentalnie zweryfikowany. Nasze badanie empirycznie pokazuje, że glimepiride hamuje SARS-CoV-2 z IC₅₀ przy 47 μM i znacznie wyższym CC₅₀ przy 2860 μM. Do zastosowań klinicznych ogólnie zaleca się, aby leki przeciwwirusowe wykazywały IC₅₀ w stężeniach submikromolarnych, aby były uważane za silne i osiągały efekt terapeutyczny przy niskich dawkach. Stąd wymagane są dalsze optymalizacje, aby zwiększyć siłę glimepiridu przeciwko SARS-CoV-2. CC₅₀ jest jednak znacznie wyższe niż jego IC₅₀ z SI wynoszącym 61, co sugeruje jego względne bezpieczeństwo, ponieważ leki z SI większymi niż 10 są uważane za bezpieczne. Aktywność przeciwwirusowa glimepiridu była osiągana poprzez dwa mechanizmy: głównie przez hamowanie wewnątrzkomórkowej replikacji wirusowej i, w mniejszym stopniu, adsorpcji wirusowej, a tym samym wnikania do komórek. Nasze odkrycie, że glimepiride hamuje replikację SARS-CoV-2, jest zgodne z zgłoszonymi przewidywaniami obliczeniowymi, że glimepiride potencjalnie ukierunkowuje się na M^pro i prawdopodobnie inne enzymy SARS-CoV-2 niezbędne do replikacji wirusowej. Ponadto, hamowanie adsorpcji wirusowej wspiera nasze ustalenia, że glimepiride ukierunkowuje się na receptor ACE2, sugerując, że wywołuje swoją aktywność przeciwwirusową poprzez podwójny mechanizm. Poprzednie badanie przy użyciu dokowania i symulacji dynamiki molekularnej zidentyfikowało glimepiride jako potencjalny lek, który może wiązać się z neuropiliną-1 (NRP1), innym receptorem gospodarza wykorzystywanym przez SARS-CoV-2 do wejścia wirusowego, wskazując na możliwy efekt kombinacyjny przeciwko wielu białkom wirusowym i/lub gospodarza.

Jeśli chodzi o argatroban, jest to antykoagulant, który działa poprzez kompetytywne i selektywne hamowanie trombiny. Jest podawany parenteralnie w zapobieganiu i/lub leczeniu małopłytkowości wywołanej heparyną, a także innych stanów zakrzepowych. Co ciekawe, sama trombina została zaangażowana w patogenezę wielu wirusów, w tym grypy, ludzkiego metapneumowirusa i wirusa syncytialnego układu oddechowego, które powodują infekcje dróg oddechowych. Wykazano, że trombina nie tylko zwiększa replikację tych wirusów, ale także pogarsza związane z nimi zapalenie tych infekcji. Dlatego antykoagulant, oprócz przeciwzapalnych i przeciwwirusowych efektów inhibitorów trombiny, może okazać się bardzo przydatny w innych zakażeniach wirusowych układu oddechowego, takich jak SARS-CoV-2. Wśród obecnie dobrze ustalonych powikłań zakażenia COVID-19 są koagulopatie związane z opornością na heparynę. W rzeczywistości dwa poprzednie badania zgłosiły skuteczne leczenie kilku pacjentów z COVID-19 z powikłaniami zakrzepowymi przy użyciu argatrobanu. W obecnym badaniu po raz pierwszy eksperymentalnie potwierdziliśmy, że argatroban może utrudniać wiązanie między ACE2 a białkiem S SARS-CoV-2, a także ujawniliśmy wpływ anty-COVID-19 argatrobanu pośredniczony głównie przez wywołanie bezpośredniego efektu wirusobójczego i w mniejszym stopniu przez hamowanie adsorpcji i replikacji wirusowej. Argatroban wykazał IC₅₀ wynoszące 20 μM i CC₅₀ wynoszące 1900 μM, a następnie SI wynoszące 95. Podobnie jak glimepiride, lek jest uważany za bezpieczny i pozwala na testowanie in-vivo ze względu na jego wysokie SI, jednak byłby uważany za średnio silny, ponieważ jego IC₅₀ jest w zakresie mikromolarnym, co wymaga dalszych optymalizacji, aby zwiększyć jego siłę.

Ranolazyna to lek podawany doustnie stosowany w leczeniu przewlekłej dławicy piersiowej. Ponadto ranolazyna ma właściwości antyarytmiczne i jest stosowana poza wskazaniami w leczeniu arytmii. Wśród powikłań związanych z COVID-19 są choroby układu sercowo-naczyniowego, w tym arytmie. Co ciekawe, kilka badań wskazuje, że ranolazyna może mieć korzystny wpływ na leczenie arytmii związanych z COVID-19. Wykazaliśmy tutaj, że ranolazyna ma aktywność przeciwwirusową przeciwko SARS-CoV-2 z IC₅₀ wynoszącym 300 μM, CC₅₀ wynoszącym 3000 μM i SI wynoszącym 10, oraz że ta aktywność jest głównie pośredniczona przez hamowanie adsorpcji wirusowej. Podkreśla to, że ranolazyna wywołuje swoją aktywność przeciwwirusową częściowo poprzez zakłócanie interakcji ACE2-Spike.

Jakie perspektywy kliniczne i wyzwania stoją przed repurposingiem leków?

Warto wspomnieć, że pomimo ich nietoksycznego wpływu na linie komórkowe, uzyskane przeciwwirusowe wartości IC₅₀ dla argatrobanu, glimepiridu i ranolazyny są wyższe niż terapeutycznie stosowane stężenia w osoczu każdego z leków dla ich obecnie zatwierdzonych wskazań; stąd, więcej badań może być wymaganych do określenia długoterminowego bezpieczeństwa i skuteczności przeciwwirusowej tych leków w wyższych dawkach. Przewidywaliśmy ostrą toksyczność doustną (LD₅₀) trzech leków przy użyciu narzędzia obliczeniowego Pro-Tox 3.0, gdzie przewidywane LD₅₀ każdego z leków okazało się znacznie wyższe niż obecnie stosowane dawki terapeutyczne. Może to wskazywać, że stosowanie tych leków do leczenia COVID-19 w dawkach wyższych niż obecnie stosowane dawki może być nadal bezpieczne. Jednak nie neguje to konieczności przeprowadzenia dalszych badań in vivo w celu walidacji tych ustaleń.

Alternatywnie, można przeprowadzić dodatkowe badania w celu zwiększenia skuteczności leków lub ich pochodnych przeciwko SARS-CoV-2. Na przykład, sposób podawania może zostać zmieniony na miejscowe podawanie do płuc w postaci aerozoli przy użyciu odpowiednich urządzeń, co może zwiększyć ich stężenie w płucach, poprawić ich skuteczność i ograniczyć ich ekspozycję na inne tkanki, tym samym obniżając ich działania niepożądane. Rozważania dotyczące przeformułowania są szczególnie ważne dla argatrobanu, który jest podawany w infuzji dożylnej, ograniczając zgodność pacjenta i jego stosowanie poza warunkami szpitalnymi. Zapobiegłoby to również niepożądanemu wpływowi antykoagulacyjnemu lub tendencjom do krwawienia, które mogą być spowodowane ogólnoustrojowym podawaniem argatrobanu u pacjentów z COVID-19, którzy nie cierpią na koagulopatie. Ponadto, środki ostrożności mogą być konieczne do stosowania przeciwcukrzycowego leku glimepiridu, ponieważ może on powodować hipoglikemię u niediabetyków pacjentów z COVID-19. Dlatego podawanie glimepiridu przez miejscowe podawanie do płuc może pomóc przezwyciężyć ten skutek uboczny. Odnośnie ranolazyny, zgłoszono, że powoduje zawroty głowy, nudności i ból głowy, gdy jest podawana w wysokich dawkach. Ponieważ uzyskana przeciwwirusowa wartość IC₅₀ dla ranolazyny wynosiła 300 μM, co jest stosunkowo wyższe niż terapeutycznie stosowane stężenia w osoczu (3,40–13,35 μM), te działania niepożądane byłyby oczekiwane i mogłyby prowadzić do przerwania leczenia. Tak więc, podawanie ranolazyny przez inhalację mogłoby zapobiec wystąpieniu jej zgłaszanych działań niepożądanych.

Oprócz rozważań dotyczących przeformułowania, łączenie tych leków z lekami obecnie zatwierdzonymi do leczenia COVID-19 mogłoby zapewnić efekt synergistyczny poprzez jednoczesne ukierunkowanie zarówno na białka wirusowe, jak i gospodarza, i może pozwolić na ich stosowanie w niższych dawkach, tym samym zmniejszając ryzyko potencjalnych działań niepożądanych każdego leku. Jednak ranolazyna ma kilka potencjalnych interakcji lekowych, w tym ritonavir/nirmatrelvir, które są kombinacją leków przeciwwirusowych zatwierdzoną do leczenia COVID-19; dlatego należy zachować ostrożność, aby nie łączyć tych leków.

Oprócz wcześniej wspomnianych środków ostrożności, próby terapeutyczne naszych leków mogą napotkać inne wyzwania, ponieważ wiadomo, że przeciwwirusowe leki ukierunkowane na gospodarza mają wyższy potencjał wywoływania zapalnych działań niepożądanych, dlatego istotne jest rozważenie testowania reakcji zapalnych tych leków in-vivo przed użyciem ich jako środków terapeutycznych dla COVID-19.

Odpowiednio, kliniczna stosowanie repurposingowanych leków zależy od wyboru odpowiedniej dawki i sposobu podawania, a także rozważenia profilu bezpieczeństwa leku, w tym jego działań niepożądanych i możliwych interakcji lekowych; wymaga to integracji nauk farmaceutycznych, a także toksykologii, aby stworzyć bezpieczniejsze ukierunkowane dostarczanie leków.

Jak pokazuje sukces leku przeciwko Eboli, remdesiviru, w leczeniu COVID-19, początkowym krokiem w repurposingu leków jest wykazanie obiecującej aktywności przeciwwirusowej in vitro, która jest później potwierdzana w badaniach przedklinicznych, a następnie w próbach klinicznych. W tym badaniu zidentyfikowaliśmy trzy leki – argatroban, glimepiride i ranolazynę – które wykazują potencjalną aktywność przeciwwirusową przeciwko SARS-CoV-2, możliwie przez hamowanie receptora ACE2 in vitro.

Podsumowując, wyniki tego badania dostarczają dowodów na aktywność anty-SARS-CoV-2 argatrobanu, glimepiridu i ranolazyny potencjalnie poprzez blokowanie receptora ACE2, co stanowi pierwszy krok w ich podróży po repurposingu leków.

Dalsze badania są potrzebne, aby zrozumieć dokładny mechanizm działania każdego leku, ponieważ chociaż wszystkie trzy leki wpływały na adsorpcję wirusową i wnikanie do komórek, wykazywały one również efekty wirusobójcze i hamujące replikację, wskazując, że mogą mieć inne cele oprócz receptora ACE2. Ponadto, eksperymenty in-vivo są konieczne, aby potwierdzić efekty przeciwwirusowe obserwowane in vitro, ocenić wymagania dotyczące dawkowania i skuteczność argatrobanu, glimepiridu i ranolazyny przeciwko COVID-19, określić profile farmakokinetyczne/farmakodynamiczne i potwierdzić ich bezpieczeństwo. Przyszłe testowanie in-vivo powinno obejmować badanie wpływu leków obserwowany u tych zwierząt pod względem skuteczności klinicznej, a także potencjalnych działań niepożądanych, lepiej odzwierciedlających odpowiedź ludzką. Próby kliniczne powinny nastąpić przed włączeniem tych leków do schematów leczenia COVID-19. Można przeprowadzić próby kliniczne fazy II, gdzie oceniana byłaby skuteczność i bezpieczeństwo trzech leków samodzielnie i w połączeniu z obecnie zatwierdzonymi lekami na COVID-19, takimi jak remdesivir. Ponadto, ze względu na ich obecnie zatwierdzone zastosowania, argatroban i ranolazyna mogłyby być testowane odpowiednio u pacjentów z COVID-19 z powikłaniami zakrzepowymi i arytmiami.

Podsumowanie

\- Spośród 19 testowanych leków, trzy substancje (argatroban, glimepiride i ranolazine) wykazały znaczącą aktywność przeciwwirusową przeciwko SARS-CoV-2 z indeksem selektywności >10.

– Mechanizm działania tych leków polega głównie na hamowaniu wiązania między wirusowym białkiem S a receptorem ACE2 gospodarza. Argatroban działa głównie wirusobójczo, glimepiride hamuje replikację wirusa, a ranolazine blokuje adsorpcję wirusową.

– Wartości IC50 dla badanych leków są wyższe niż obecnie stosowane dawki terapeutyczne, co wymaga dalszych badań nad bezpieczeństwem i skutecznością wyższych dawek.

– Potencjalne rozwiązania obejmują: zmianę sposobu podawania na inhalacje, łączenie z innymi lekami przeciw COVID-19 oraz modyfikację formulacji w celu zwiększenia skuteczności i ograniczenia działań niepożądanych.

– Przed włączeniem tych leków do terapii COVID-19 konieczne są dalsze badania in vivo oraz próby kliniczne potwierdzające ich skuteczność i bezpieczeństwo.

Bibliografia

El Sobky Shereen A., Fawzy Injie O., Ahmed Mahmoud S., Ragheb Manon, Hamad Merna H.M., Bahaaeldin Rowan, Fahim Salma A., Saad Rana, Khalil Ziad A., Mahmoud Sara H., Mostafa Ahmed, Ali Mohamed A., Sadek Hesham A., El-Ekiaby Nada and Abdelaziz Ahmed I.. Drug repurposing of argatroban, glimepiride and ranolazine shows anti-SARS-CoV-2 activity via diverse mechanisms. Heliyon 2025, 11(3), 470-473. DOI: https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2025.e41894.