Mikronakłuwacze z nanokryształami – nowa metoda leczenia cukrzycy typu 2

Czy innowacyjne podejście poprawia terapię cukrzycy?

Cukrzyca typu 2 stanowi globalny problem zdrowotny – liczba dorosłych chorujących na cukrzycę na świecie wzrosła pięciokrotnie ze 108 milionów w 1980 roku do 537 milionów w 2021, powodując 6,7 miliona zgonów. Szacuje się, że 90% dorosłych z cukrzycą cierpi na typ 2 tej choroby. Leczenie cukrzycy typu 2 obejmuje modyfikację stylu życia, leki doustne oraz insulinoterapię. W tym kontekście, naukowcy stale poszukują innowacyjnych metod dostarczania leków przeciwcukrzycowych, które mogłyby zwiększyć skuteczność terapii i komfort pacjentów.

Glimepirid to doustny lek stosowany w leczeniu cukrzycy typu 2, należący do drugiej generacji pochodnych sulfonylomocznika. Działa poprzez blokowanie kanałów potasowych wrażliwych na ATP (kanały KATP), co prowadzi do depolaryzacji komórek beta trzustki i w rezultacie do wydzielania insuliny. Oprócz działania trzustkowego, wykazano, że glimepirid zmniejsza insulinooporność i zwiększa wątrobowe wykorzystanie glukozy w modelach zwierzęcych. W porównaniu z innymi pochodnymi sulfonylomocznika, glimepirid wykazuje niższe ryzyko hipoglikemii, co jest istotną zaletą kliniczną.

Przezskórne podawanie leków przeciwcukrzycowych jest obszarem intensywnych badań, ponieważ metoda ta pozwala ominąć efekt pierwszego przejścia przez wątrobę i zmniejsza ryzyko hipoglikemii. Systemy przezskórnego dostarczania leków oferują liczne korzyści, w tym minimalizację szczytowych stężeń leku i zmniejszenie częstości dawkowania, co prowadzi do lepszego przestrzegania zaleceń przez pacjentów. “Systemy dostarczania leków oparte na mikronakłuwaczach wykazały duży potencjał w leczeniu cukrzycy” – podkreślają autorzy badania.

Mikronakłuwacze rozpuszczalne to miniaturowe igły wykonane z polimerów rozpuszczalnych w wodzie, o długości mniejszej niż 1000 μm, przeznaczone do rozpuszczenia po aplikacji i penetracji warstwy rogowej naskórka (stratum corneum) przy minimalnej inwazyjności. Warstwa rogowa naskórka składa się z martwych zrogowaciałych komórek, które powstają w wyniku końcowego różnicowania głębszych żywych keratynocytów naskórka, zapewniając hydrofobową ochronę głębszych warstw przed środowiskiem zewnętrznym. Rozpuszczalne mikronakłuwacze polimerowe mają kilka zalet, w tym łatwość przygotowania i utylizacji oraz stosunkowo wysoką zdolność ładowania leków w porównaniu z innymi rodzajami mikronakłuwaczy.

Pomimo powszechnego stosowania glimepiridu drogą doustną, ta metoda podania wiąże się z wieloma ograniczeniami farmakokinetycznymi i związanymi z bezpieczeństwem. Głównym problemem jest intensywny metabolizm wątrobowy pierwszego przejścia, który nie tylko zmniejsza biodostępność leku, ale również przyczynia się do zmienności odpowiedzi terapeutycznej między pacjentami. Dodatkowo, doustny glimepirid jest związany z działaniami niepożądanymi ze strony przewodu pokarmowego i ryzykiem hipoglikemii zależnej od dawki, szczególnie gdy stężenie leku w osoczu gwałtownie wzrasta po wchłonięciu. Te problemy podkreślają potrzebę alternatywnych strategii dostarczania, które mogą ominąć przewód pokarmowy, jednocześnie utrzymując kontrolowane i długotrwałe uwalnianie leku.

Czy mikronakłuwacze z nanokryształami to skuteczna innowacja?

W przedstawionym badaniu naukowcy opracowali i ocenili system mikronakłuwaczy rozpuszczalnych oparty na matrycy PVA/sacharoza, zawierający nanokryształy glimepiridu, w celu poprawy przezskórnego dostarczania leku w leczeniu cukrzycy. Badacze szczegółowo ocenili właściwości mechaniczne mikronakłuwaczy, wykorzystując modele penetracyjne Parafilm®, wyciętą skórę mysią i ludzką. Dodatkowo zbadano skuteczność przeciwcukrzycową in vivo mikronakłuwaczy załadowanych glimepiridem u myszy BALB/c, oceniając zmiany poziomu glukozy we krwi i insuliny w surowicy w czasie. Aby ocenić możliwe zalety podawania przezskórnego, porównano skuteczność terapeutyczną formulacji mikronakłuwaczy z glimepiridem podawanym doustnie w równoważnej dawce.

Przygotowanie nanokryształów glimepiridu stanowiło kluczowy etap badania. Naukowcy wykorzystali metodę bezpośredniej nanoprecypitacji z zastosowaniem sonikacji sondą. Dimetyloformamid (DMF) został użyty jako rozpuszczalnik, a woda destylowana zawierająca stabilizator jako antyrozpuszczalnik. Naukowcy wykorzystali dwa surfaktanty – PVP i SLS – do stabilizacji wielkości nanokryształów. Wykazano, że nanokryształy przygotowane przy użyciu SLS miały znacznie mniejszy rozmiar przy tej samej koncentracji w porównaniu z PVP. Ponadto, glimepirid wykazał znaczącą redukcję wielkości cząstek po zmieleniu w moździerzu z tłuczkiem – z 772 nm do 348 nm. Ta metoda redukcji wielkości poprzez suche mielenie jest wszechstronna i tania, co stanowi zaletę w kontekście produkcji.

Do analizy wielkości cząstek i wskaźnika polidyspersyjności (PI) wykorzystano dynamiczne rozpraszanie światła. Obrazowanie nanokryształów SLS przeprowadzono za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Analiza różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC) i analiza termograwimetryczna (TGA) pozwoliły na ocenę właściwości termicznych nanokryształów glimepiridu.

Mikronakłuwacze załadowane zmielonymi nanokryształami glimepiridu (GLIM_MN) przygotowano metodą dwuwarstwowego wirowania. Krótko mówiąc, 8 mg zmielonych nanokryształów glimepiridu i 4 g 23% w/w PVA/15% w/w wodnego roztworu sacharozy mieszano przy użyciu mieszadła magnetycznego w temperaturze 75°C. Przygotowaną mieszaninę polimerową wlano następnie do form mikronakłuwaczy z poli(dimetylosiloksanu) (PDMS) o wymiarach 15 × 15, o głębokości 600 μm i długości podstawy 200 μm. Następnie formy wirowano z prędkością 2500 rpm przez 20 minut, aby wypełnić otwory form. Nadmiar mieszaniny usunięto za pomocą szpatułki, a formy pozostawiono na 24 godziny w temperaturze pokojowej do wyschnięcia igieł. Roztwór polimerowy na bazie wodnej 23% w/w PVA dodano do form i wirowano z prędkością 2500 rpm przez 20 minut. Mikronakłuwacze pozostawiono na 24 godziny do wyschnięcia, a następnie delikatnie wyjęto z form.

Analiza SEM obrazów GLIM_MN (mikronakłuwaczy załadowanych glimepiridem) wykazała układ mikronakłuwaczy o kształcie piramidy, o wysokości 500 ± 14 μm z ostrymi końcówkami. Mikronakłuwacze miały długość podstawy 176 ± 4 μm i zawierały 132 ± 19 μg glimepiridu na matrycę. Taki ostry koniec powinien zwiększać zdolność gładkiego przenikania przez skórę. Mikronakłuwacze wykazały niewielką deformację na końcówkach, ale nie zaobserwowano znaczącej zmiany w ich wysokości po zastosowaniu siły 32 N przy 0,5 mm/s. Siła wymagana do skutecznej penetracji ludzkiej skóry wynosi 0,058 N/igłę, co daje 13,05 N dla całej matrycy mikronakłuwaczy. Oznacza to, że opracowana formulacja może wytrzymać wymaganą siłę wprowadzenia bez uszkodzenia.

Badanie penetracji przez Parafilm wykazało, że GLIM_MN był w stanie całkowicie przeniknąć pierwszą i drugą warstwę ułożonych warstw Parafilm. Parafilm składa się z wosków parafinowych i poliolefin, dzięki czemu przypomina hydrofobową naturę warstwy rogowej naskórka. Znaczna część mikronakłuwaczy była w stanie przeniknąć trzy warstwy Parafilm, co odpowiada głębokości 390 μm. W badaniu GLIM_MN wykazał pełną penetrację matrycy na ogolonej skórze myszy, a głębokość penetracji wynosiła 480 ± 15 μm. Z kolei penetracja w ogoloną skórę ludzką wyniosła 276 ± 65 μm. “Penetracja mikronakłuwaczy w skórę ludzką jest znacznie mniejsza niż głębokość penetracji skóry myszy ze względu na różnice histologiczne i fizjologiczne w skórze między myszami a ludźmi” – wyjaśniają badacze.

Do badania zdolności penetracyjnych mikronakłuwaczy wykorzystano wyciętą skórę mysią i ludzką. Próbkę ludzkiej skóry uzyskano od 38-letniej kobiety poddawanej operacji plastycznej brzucha w Szpitalu Uniwersytetu Jordańskiego. Uzyskano świadomą zgodę uczestnika, a wszystkie procedury przeprowadzono zgodnie z Deklaracją Helsińską i zatwierdzono przez komisję etyczną Szpitala Uniwersytetu Jordańskiego. Równolegle, mysią skórę wycięto z 4-6-tygodniowych samic myszy (BALB/c). Wszystkie procedury i eksperymenty przeprowadzone na myszach BALB/c w tym badaniu zostały wykonane zgodnie z Wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych Uniwersytetu Jordańskiego, a eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt na Dziekanacie Badań Naukowych Uniwersytetu Jordańskiego.

Czy przezskórne dostarczanie gwarantuje lepsze wyniki terapeutyczne?

Uwalnianie in vitro glimepiridu z GLIM_MN wykazało stopniowe i całkowite uwolnienie w ciągu 6 godzin. Badania z wykorzystaniem komórek Franza wykazały, że mikronakłuwacze rozpuszczalne mogą osiągnąć trwałe i stopniowe uwalnianie leku po zastosowaniu na wyciętej skórze myszy, przy czym profile uwalniania często rozciągają się na godziny do dni, w zależności od polimerów użytych w formulacjach i właściwości fizykochemicznych zawartego leku.

Wysokość GLIM_MN stopniowo zmniejszała się po inkubacji w wyciętej skórze myszy i wymagała 20 minut do całkowitego rozpuszczenia. Wcześniejsze badania wykazały, że mikronakłuwacze na bazie PVA mogą rozpuścić się w wyciętej skórze w ciągu 60 minut lub krócej. Włączenie glimepiridu jako nanokryształów w mikronakłuwacze oferuje kilka zalet w porównaniu z jego formą masową, szczególnie pod względem rozpuszczalności, stabilności i kinetyki uwalniania. Nanokryształy znacznie zwiększają pozorną rozpuszczalność leku i szybkość rozpuszczania ze względu na zwiększoną powierzchnię, co jest szczególnie korzystne dla słabo rozpuszczalnych w wodzie leków, takich jak glimepirid. W przeciwieństwie do form amorficznych, nanokryształy oferują również lepszą stabilność fizyczną i chemiczną, minimalizując ryzyko rekrystalizacji i degradacji podczas przechowywania lub po podaniu. Ponadto, formulacje nanokrystaliczne mogą umożliwić bardziej kontrolowane i trwałe uwalnianie leku, co jest pożądane dla osiągnięcia długotrwałych poziomów terapeutycznych przez drogę przezskórną.

W badaniach in vivo zarówno GLIM_MN, jak i GLIM_oral (glimepirid podawany doustnie) wykazały znacznie niższe poziomy glukozy we krwi w porównaniu z grupą nieleczoną, z maksymalnym efektem obniżania glukozy we krwi po 5 godzinach od podania. Potwierdza to, że nienaruszony glimepirid przeszedł z naskórka do skóry właściwej, gdzie naczynia krwionośne mogą transportować lek do działania ogólnoustrojowego. Zarówno grupy leczone GLIM_oral, jak i GLIM_MN wykazały wzrost poziomu insuliny w surowicy po 5 godzinach. Poziomy glukozy we krwi w grupie leczonej GLIM_oral były niższe niż w grupie leczonej GLIM_MN w ciągu pierwszych dwóch godzin po podaniu. “Wyższy efekt hipoglikemiczny dla GLIM_oral we wczesnych punktach czasowych wynika z faktu, że glimepirid podlega biotransformacji oksydacyjnej głównie za pośrednictwem enzymu CYP2C9, który jest obficie obecny w przewodzie pokarmowym i wątrobie, co prowadzi do powstania jego aktywnego metabolitu (M1)” – tłumaczą autorzy badania.

Ten przedukładowy metabolizm może przyczynić się do szybszej odpowiedzi farmakodynamicznej po podaniu doustnym. Natomiast przezskórna droga mikronakłuwaczy omija przewód pokarmowy i metabolizm pierwszego przejścia, wymagając, aby lek macierzysty dotarł do krążenia ogólnoustrojowego przed poddaniem się metabolizmowi wątrobowemu. To opóźnienie w biotransformacji może wiarygodnie wyjaśniać stosunkowo wolniejszy początek obserwowany przy podawaniu mikronakłuwaczy, pomimo zazwyczaj szybkiego profilu absorpcji związanego z drogą przezskórną. Dlatego opóźniony efekt może być bardziej związany z różnicami w aktywacji metabolicznej niż wyłącznie z kinetyką absorpcji, co zostało potwierdzone przez wyższe poziomy insuliny dla GLIM_oral w porównaniu do GLIM_MN po 5 godzinach.

Glimepirid ma T_max 2-3 godziny po pojedynczej dawce doustnej u ludzi. Ponadto, w poprzednim badaniu, maksymalna aktywność insuliny i obniżania glukozy dla doustnego glimepiridu została osiągnięta po 2-3 godzinach, po doustnej dawce glimepiridu u pacjentów z cukrzycą typu 2. W przedstawionym badaniu na myszach BALB/c, maksymalne obniżenie glukozy wystąpiło po 5 godzinach. Jest to prawdopodobnie spowodowane wyższym tempem metabolizmu myszy i różnicami w aktywności enzymatycznej myszy w porównaniu do ludzi. Te specyficzne dla gatunku szlaki metaboliczne mogą zmienić szybkość, z jaką lek jest przetwarzany i eliminowany, wpływając na jego profil farmakokinetyczny, w tym T_max. Ponadto, podawanie glimepiridu bez jedzenia przez pierwsze 5 godzin może wyjaśniać ciągły spadek poziomu glukozy we krwi w tym okresie.

Czy taka forma podania może być bezpieczna dla pacjentów? Badacze sprawdzili poziom białka C-reaktywnego (CRP) – kluczowego biomarkera stanu zapalnego, produkowanego przez wątrobę w odpowiedzi na cytokiny, takie jak IL-6 i TNF-α. Jego szybki wzrost czyni go użytecznym do oceny odpowiedzi zapalnych na mikronakłuwacze, które penetrują skórę w celu dostarczenia leku z minimalnym bólem, chociaż ich potencjał do wywoływania stanu zapalnego musi być oceniony pomimo celu, jakim jest zmniejszenie uszkodzenia tkanki. Monitorowanie CRP po aplikacji pomaga określić, czy różne typy mikronakłuwaczy wywołują nadmierne odpowiedzi immunologiczne. Badanie nie wykazało istotnej różnicy między grupą leczoną GLIM_MN a grupą nieleczoną, Blank_MN lub grupami GLIM_oral. Jedyną grupą, która wykazała znaczący wzrost białka C-reaktywnego, była grupa leczona karagenem (kontrola pozytywna). W grupie leczonej karagenem dwie z pięciu myszy zmarły przypuszczalnie z powodu stanu zapalnego, a reszta myszy przeżyła cały kurs badania. Karagen był używany do wywoływania stanu zapalnego u myszy i może podnosić poziomy białka C-reaktywnego w surowicy. Wyniki te pokazują, że opracowana formulacja mikronakłuwaczy powoduje minimalne uszkodzenie tkanki i nie wywołuje odpowiedzi prozapalnej. Wcześniej wykazano, że rozpuszczalne mikronakłuwacze wykorzystujące biokompatybilne polimery, w tym poli(winylopirolidon), utrzymują integralność skóry i nie wywołują stanu zapalnego.

Jakie są praktyczne implikacje tych wyników dla lekarzy? Maksymalna dzienna dawka glimepiridu wynosi 8 mg dziennie, a skuteczne stężenie to 0,5-8 mg dziennie. Tak potężna dawka jest korzystna, ponieważ wysokie dawki mogą ograniczać użyteczność dostarczania leków przez mikronakłuwacze rozpuszczalne, które mogą zatrzymać tylko małe dawki ze względu na ich niewielką strukturę. Dlatego włączenie glimepiridu do mikronakłuwaczy rozpuszczalnych ma duży potencjał w obniżaniu poziomu glukozy we krwi w cukrzycy typu 2.

Wcześniej glimepirid został włączony do formulacji nanoemulgelu w celu zwiększenia jego przezskórnej penetracji, ponieważ ma on niską przepuszczalność skórną. Inne przezskórne formulacje kompleksów glimepiridu również wykazały poprawioną przezskórną dostawę jako alternatywę dla podawania doustnego. Badania te miały na celu modyfikację formulacji, umożliwiając efektywną dostawę przezskórną. Dlatego postulowano, że aktywne nakłuwanie i penetracja warstwy rogowej naskórka, głównej bariery skórnej, może poprawić działanie przeciwcukrzycowe glimepiridu.

Czy ta metoda podania może stać się powszechna w praktyce klinicznej? Organy regulacyjne, takie jak amerykańska FDA, coraz częściej wymagają sterylności polimerowych plastrów z mikronakłuwaczami, zwłaszcza gdy są stosowane do przezskórnego dostarczania leków ogólnoustrojowych, szczepionek lub biologicznych, ze względu na potencjalne ryzyko infekcji skóry i zanieczyszczenia mikrobiologicznego. Wymóg ten wprowadza wyzwania produkcyjne i dystrybucyjne, w tym potrzebę aseptycznego przetwarzania lub końcowych metod sterylizacji, takich jak obróbka promieniowaniem gamma, które nie naruszają integralności mechanicznej lub chemicznej mikronakłuwaczy. Zapewnienie stabilności przechowywania jest również kluczowe, szczególnie w utrzymaniu wydajności PVA lub innych platform polimerowych stosowanych w formulacjach mikronakłuwaczy w różnych warunkach środowiskowych, co może wymagać środków osuszających lub przechowywania w łańcuchu chłodniczym w zależności od formulacji.

Badania wykazały, że plastry z mikronakłuwaczami mogą niezawodnie penetrować warstwę rogową naskórka (zewnętrzną warstwę skóry) przy siłach zaledwie 5-10 N, co oznacza, że normalny nacisk kciuka jest wystarczający do skutecznej aplikacji w wielu przypadkach. Jest to widoczne, ponieważ opracowana formulacja mikronakłuwaczy w pełni penetrowała Parafilm, skórę myszy i skórę ludzką. W przypadku powtarzalnego wprowadzania, samodzielne podawanie przez pacjentów lub opiekunów budzi obawy dotyczące spójnej penetracji skóry i dostarczania dawki. Jednak jeśli są stosowane przez nacisk kciuka, użytkownicy mogą wykorzystać mechanizmy informacji zwrotnej, takie jak zmiany koloru, które są badane w celu potwierdzenia prawidłowego użycia. W badaniu zmiana koloru została wykorzystana w mikronakłuwaczach załadowanych błękitem metylenowym, aby potwierdzić efektywną dostawę do wyciętej ludzkiej skóry.

Rozpuszczalne mikronakłuwacze, w zależności od ich projektu i materiału, ogólnie rozpuszczają się i uwalniają swój ładunek w ciągu minut do dni i mogą być używane do natychmiastowej lub trwałej dostawy przezskórnej. Utylizacja jest kolejnym ważnym czynnikiem, szczególnie w środowiskach ubogich w zasoby, gdzie brak pojemników na ostre przedmioty lub odpowiednich systemów gospodarki odpadami może prowadzić do zanieczyszczenia środowiska lub zagrożeń bezpieczeństwa. Aby rozwiązać ten problem, biodegradowalne lub rozpuszczalne mikronakłuwacze, które nie pozostawiają ostrych odpadów, są coraz częściej preferowane do bezpiecznego, niskokosztowego wdrażania.

Podsumowując, badacze z powodzeniem opracowali wytrzymałą formulację nanokryształów glimepiridu w mikronakłuwaczach rozpuszczalnych na bazie PVA/sacharozy. Dawka glimepiridu zawarta w mikronakłuwaczach była odpowiednia do obniżenia poziomu glukozy we krwi i zwiększenia poziomu insuliny w surowicy u myszy. Ponadto, formulacja mikronakłuwaczy przebijała i penetrowała ludzką skórę oraz penetrowała skórę myszy bez wywoływania stanu zapalnego. Mikronakłuwacze oferują obiecującą alternatywę dla dostarczania leków o słabej przepuszczalności skórnej, takich jak glimepirid, umożliwiając wchłanianie ogólnoustrojowe, obniżanie poziomu glukozy we krwi, zwiększanie produkcji insuliny i unikanie stanu zapalnego. Ta minimalnie inwazyjna metoda rozwiązuje kluczowe wyzwania związane z doustnym podawaniem leków przeciwcukrzycowych i zapewnia dodatkowe korzyści, w tym lepsze przestrzeganie zaleceń przez pacjentów (szczególnie dla pacjentów z dysfagią), unikanie działań niepożądanych ze strony przewodu pokarmowego i możliwość długotrwałego uwalniania leku.

Podsumowanie

Badanie koncentruje się na innowacyjnym systemie dostarczania glimepiridu – leku przeciwcukrzycowego – za pomocą rozpuszczalnych mikronakłuwaczy zawierających nanokryształy substancji czynnej. Naukowcy opracowali formulację opartą na matrycy PVA/sacharoza, która wykazała zdolność do skutecznej penetracji skóry i kontrolowanego uwalniania leku. System charakteryzuje się odpowiednią wytrzymałością mechaniczną i zdolnością do pełnej penetracji warstwy rogowej naskórka. Badania in vivo potwierdziły skuteczność terapeutyczną poprzez obniżenie poziomu glukozy we krwi i zwiększenie stężenia insuliny w surowicy. Co istotne, metoda nie wywołuje stanu zapalnego i oferuje alternatywę dla pacjentów z trudnościami w przyjmowaniu leków doustnych. Technologia ta może stanowić przełom w terapii cukrzycy typu 2, zapewniając lepsze przestrzeganie zaleceń przez pacjentów i minimalizując działania niepożądane związane z podaniem doustnym.